Анф і анця. Антинуклеарний фактор (АНФ)

У медицині розрізняють специфічні стани, за яких захисні клітини починають атакувати власний організм, - аутоімунні захворювання. Більшість таких хвороб протікають у хронічній формі та є потенційно небезпечними, оскільки здатні викликати серйозні проблеми роботи певних органів та систем. Це нерідко призводить до інвалідності та тяжких наслідків.

Можливості сучасної медицини великі, і виявити всі ці зміни вдається на ранній стадії та своєчасно розпочати лікування. Одним із найчастіших досліджень, які застосовуються для діагностування цих станів, є аналіз на антинуклеарні антитіла, скорочено АНА.

Аналіз АНА – це самий інформативний методпостановки діагнозу при підозрі на будь-які аутоімунні розлади, в основному, це захворювання сполучної тканини. Але трапляються також наявність антитіл при злоякісних процесах, інфекційних тощо.

Аналіз АНА найінформативніший метод постановки діагнозу при підозрі на будь-які аутоімунні розлади

Найбільша чутливість антитіл до таких недуг:

1. Системний червоний вовчак.
2. Ревматоїдний артрит.
3. Хвороби Шегрена.

Ці клітини можуть бути виявлені також приблизно у третини пацієнтів, які страждають на хронічну форму гепатиту.

На збільшення показників впливають різні фактори. Зокрема, малярія, лейкоз, інфекційний мононуклеоз та багато іншого.

Разом із виявленням АНА під час виконання дослідження важливо оцінити рівень вмісту таких імуноглобулінів, як IgA, IgM, IgG. Виявлення даних складових у крові у пацієнтів може вказувати на великі шанси появи ревматичних патологій та колагенозів.

Якщо ж взаємозв'язок між вмістом антитіл та симптомами не був виявлений, сама наявність АНА в крові вказує на вибір правильної тактики лікування. Тривале збереження високих титрів говорить про невтішний стан справ.Зниження цих титрів говорить про ремісію патології, набагато рідше про швидку смерть.

Разом з тим, дані антитіла можуть бути виявлені у певного відсотка здорових осіб і титри АНФ можуть виходити за межі норми.

Показання до проведення дослідження

Трактувати результати вправі лікар імунолог та будь-який дипломований фахівець, залежно від галузі ураження.

Показаннями для проведення даного дослідженняслужать:

1. Виявлення системних захворювань, і навіть аутоімунних порушень без явних симптомів.
2. Виявлення системного червоного вовчаку та його комплексне дослідження, підбір стратегії лікування.
3. Виявлення лікарського вовчаку.
4. Наявність певних клінічних проявів, таких як, тривала лихоманка без явної на те причини, ламкість суглобів та їх болючість, шкірний висип, ломота м'язів, високий рівень стомлюваності.
5. Ознаки симптоматичних проявів змішаних захворювань: хвороби шкіри та внутрішніх органів, судомні стани, збільшення температурних показників
6. Призначення медикаментів дизопірамід, гідралазин та інше.

Види обстеження

Вовчакова смуга

Виявити антитіла у крові вдається двома способами. Перша методика називається непряма імунофлуоресцентна мікроскопія.За наявності антитіл вони зв'язуватимуться зі специфічними ядерними антигенами. Використовуються елементи, які світяться в окремому спектрі. Під мікроскопом утворюється можливість виявлення типу світіння.

Докладніше про те, що таке міофасціальний синдром і як його лікують

Цей спосіб визнаний найкращим для визначення значення антинуклеарних антитіл. Також методика отримала другу назву - вовчакові тест-смуги.
Другим методом діагностування є ферментний імунний аналіз.Його сенс у тому, що антитіла, що у крові, потрапляють у взаємозв'язок з антигеном й у результаті розчин змінює свій відтінок.

Важливо підкреслити,що позитивний скринінг може бути єдиним приводом для постановки діагнозу.

Обов'язково призначається додаткове дослідження, за допомогою якого вдається визначити недугу на ранній стадії. У разі негативного скринінгу можна припускати повна відсутністьпорушень. Однак це зовсім не виключає наявності у пацієнта аутоімунного захворювання.

Здається кров на антинуклеарний чинник разом із іншими аналізами.Але на кінцевий результат впливає прийом деяких медикаментів та наявність у пацієнта патологій хронічного та гострого перебігу. Розібрати всі ці моменти допоможе спеціаліст, потім встановить вірний діагноз і порадить, як діяти далі.

Як правильно підготуватися до дослідження

Матеріалом для аналізу є венозна кров.

Особливості підготовки:

1. Матеріал беруть на голодний шлунок.Після останньої трапези має пройти щонайменше 8 годин. Допустимо пити якісну фільтровану воду без газу.
2. Попередньо за дві години перед забором крові виключається куріння та використання нікотинових продуктів.
3. За кілька днів до здійснення маніпуляції виключається споживання спиртних напоїв та енергетиків, заборонено займатися важкою фізичною працею.
4. За два тижні має повністю виключатися прийом ліків,зокрема, гормонів, антибіотиків та інших медикаментів.
5. З метою підтвердження дослідження важливо повторити скринінг за два тижні.

Матеріалом для аналізу є венозна кров

Чекайте на результати протягом 48 годин після процедури. Можливе отримання даних в екстреному порядку протягом 3 годин.

Трактування результатів

При якісному дослідженні можуть бути отримані такі результати:

• нижче 0,9-негативний, норма;
• значення від 0,9 до 1,1 – сумнівний;
• понад 1,1 – позитивний.

Пацієнти часто запитують: антинуклеарний фактор 1:160 норма чи ні? Все, що вище за цей показник, виходить за межі норми.

Існує ряд захворювань, при яких захисна система приймає клітини власного організму за чужорідні, після чого починає помилково атакувати їх. Більшість аутоімунних патологій мають хронічну формуі становлять серйозну загрозу здоров'ю. Для того щоб виявити ці недуги на ранній стадії їх розвитку, лікарі призначають аналіз АНФ. Ця абревіатура розшифровується як «антинуклеарний фактор». У деяких висновках дослідження позначається як АНА. Значення розшифровується як «аналіз антинуклеарні антитіла». АНФ – це клінічно значущий показник, що допомагає лікареві скласти максимально ефективну схему лікування та не допустити розвитку ускладнень.

Суть методу

Біологічним матеріаломдля дослідження є кров. При проникненні в організм будь-якого патогенного мікроорганізму імунна системапочинає виробляти специфічні антитіла, завданням яких є знищення чужорідних антигенів. Суть методу і полягає у виявленні та кількісному визначенні цих речовин у рідкій сполучній тканині.

Лікарі стверджують, що АНФ-аналіз крові - це лабораторний, який має високий ступіньінформативність. З його допомогою можна виявити будь-які аутоімунні патології навіть на ранній стадії їх розвитку.

Специфічні антитіла також нерідко виявляються у людей, які страждають від тяжкої форми гепатиту, онкології та деяких інфекційних захворювань. Ці речовини можуть бути виявлені і у здорових людей. Подібна ситуація вимагає комплексного підходувиявлення причини.

АНФ-аналіз іноді має на увазі оцінку кількісного вмісту імуноглобулінів. Їх наявність може свідчити про розвиток колагенозів та захворювань ревматичного характеру.

Показання

Важливо знати, що АНФ-аналіз крові – це дослідження, яке призначається з метою підтвердження чи виключення наявності аутоімунних патологій, а також з метою оцінки ефективності проведеного лікування.

Запідозрити недугу лікар може за такими симптомами:

• Довго зберігається стан лихоманки без явних причин.
• Болісні відчуття у суглобах.
• Підвищений ступінь стомлюваності.
• Ломота в м'язах та суглобах.
• Шкірні прояви без явних причин.
• Часті епізоди м'язових судом.
• Підвищена температура тіла.
• Зменшення маси тіла.
• Регулярні епізоди нудоти.
• Головний біль.
• Порушення слуху.
• Діарея.

Крім того, АНФ-аналіз призначається за підозри на наявність ревматичного захворювання. Дослідження проводиться після отримання результатів лабораторної діагностики, в яких збільшено показники ШОЕ, ЦВК та С-реактивного білка.

Що показує

АНФ-аналіз крові дозволяє виявити патологію аутоімунного характеру. Дослідження інформативно щодо наступних захворювань:

• Системний червоний вовчак.
• гострого розсіяного енцефаломієліту.
• Хвороби Шегрена.
• Ревматоїдний артрит.
• Вогнищева алопеція.
• Хвороби Аддісона.
• Анкілозуючий спондиліт.
• Антифосфоліпідного синдрому.
• Аутоімунні гемолітичної анемії.
• Бульозного пемфігоїду.
• Аутоімунного гепатиту.
• Глютенова хвороба.
• Автоімунних патологій внутрішнього вуха.
• Хвороби Чагаса.
• Синдрому Черджа-Строс.
• Хронічної обструктивної хвороби легень.
• Дерматоміозит.
• Хвороби Крона.
• Цукрового діабетуІ типу.
• Синдрому Гудпасчера.
• Тиреоїдиту Хашимото.
• Базедової хвороби.
• Синдрому Гійєна-Барре.
• Хвороби Кавасакі.
• Гнійного гідраденіту.
• Первинної нефропатії.
• Ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура.
• Інтерстиціальний цистит.
• Ерітематозний вовчак.
• Синдрому Шарпа.
• Кільцеподібної склеродермії.
• Розсіяного склерозу.
• Нарколепсія.
• Нейроміотонії.
• Звичайна пухирчатка.
• Псоріаза.
• Феномена Рейно.
• Васкуліту.
• Гранулематоз Вегенера.

Це неповний перелік захворювань. Важливо, що аналіз АНФ показує розвиток аутоімунних патологій на ранній стадії їх перебігу. Це дозволяє лікарю визначитися з тактикою лікування, а надалі оцінити його ефективність.

Підготовка

Забір біоматеріалу здійснюється в ранковий час. Здавати кров необхідно натще. Останній прийом їжі повинен бути здійснений щонайменше за 4 години. При цьому пити воду можна в будь-який час і в будь-яких кількостях. Під забороною вживання алкоголю.

За 1 день до дослідження показано спокій. Фізичні та психоемоційні навантаження нерідко призводять до хибного результату. За півгодини до здавання крові заборонено палити.

Необхідно повідомити лікаря про прийняті медикаменти під час призначення ним аналізу АНФ. Це пов'язано з тим, що активні компонентидеяких препаратів провокують вироблення антитіл і можуть стати причиною лікарського вовчаку. Хибнонегативні результати нерідко є наслідком прийому глюкокортикостероїдів.

Якщо пацієнту було призначено фізіопроцедури або інструментальні обстеження, їх необхідно проводити лише після здачі крові.

Забір біоматеріалу

Він здійснюється в ранкові години. Біологічним матеріалом є венозна кров. Її паркан проводиться відповідно до стандартного алгоритму. Як правило, кров береться з вени, розташованої на ліктьовому згині.

Після того, як рідка сполучна тканина буде отримана, з неї виділять сироватку. Саме вона необхідна щодо аналізу.

Види досліджень та їх опис

В даний час виявити антитіла в біоматеріалі можна декількома способами:

1. За допомогою непрямої імунофлуоресцентної мікроскопії. Якщо специфічні речовини є в крові, вони почнуть зв'язуватися з особливими ядерними антигенами. У лабораторіях використовуються елементи, які здатні світитись в окремому спектрі. Потім біоматеріал ретельно вивчається під мікроскопом. Захворювання можна запідозрити на кшталт світіння. Цей спосіб визнаний найінформативнішим щодо визначення значення антинуклеарних антитіл. Одним із різновидів методики є дослідження з використанням клітин НЕр. Аналіз АНФ у разі передбачає забір біоматеріалу і з гортані. Процес не пов'язаний із виникненням болючих та інших дискомфортних відчуттів. Важливо знати, що аналіз крові АНФ НЕР-2 - це наразі найточніше дослідження. Епітеліальні клітини з гортані інкубують із сироваткою, після чого їх також з'єднують із флуоресцентними речовинами.
2. Його суть полягає в тому, що коли відбувається взаємозв'язок антитіл і антигенів, колір розчину змінюється. Наявність того чи іншого відтінку дозволяє запідозрити наявність певної патології.

Розшифровкою АНФ-аналізу повинен займатися лікар. За наявності позитивних результатів досліджень призначаються додаткові випробування. Остаточний діагноз не ставиться виходячи з висновку одного аналізу.

Нормальні значення

Найкращим результатом є той, у якому антинуклеарні антитіла відсутні. Однак варто пам'ятати про те, що вони можуть виявитися і у здорових людей. І тут показано проведення повторного дослідження.

Норма аналізу АНФ – титр не більше 1:160. При цьому цей показник актуальний як для дорослих, так і для дітей.

Під час розшифрування АНФ-аналізу крові важливо враховувати таку інформацію:

• Низькі титри є гарантією того, що патології аутоімунного характеру немає. Згідно зі статистикою, у 5% пацієнтів із результатами дослідження негативні.
• Якщо у людини є всі симптоми аутоімунного захворювання, а аналіз при цьому свідчить про зворотне, лікар не виключає наявність недуги. У таких ситуаціях додатково проводиться імуноферментне дослідження.

Аналіз АНФ, здійснений за допомогою клітин нер-2, вважається нормальним, якщо титр не вище 1:160. Результат понад 1:640 свідчить про загострення ревматичних патологій. У період ремісії захворювання титр знижується до 1:320. При цьому тільки лікар зможе виявити той факт, про що говорить такий низький показник, ґрунтуючись на даних анамнезу та індивідуальних особливостяхздоров'я пацієнта.

АНФ підвищено

Зв'язуючись із антигенами, утворюють імунний комплекс. Останній, у свою чергу, є пусковим фактором розвитку запального процесуу стінках судин. Внаслідок цього у людини з'являються перші тривожні симптоми системних захворювань. Аналіз показує високі титри.

І тут патологію можна виявити, визначивши тип світіння. Інтерпретація результатів:

• Гомогенне. Подібне світіння може свідчити про наявність системного червоного вовчаку, хронічному гепатиті та склеродермії.
• Периферичний. Завжди говорить про розвиток
• Гранулярне. Можливі захворювання: синдром Шегрена, системний червоний вовчак, ревматоїдний артритзмішана патологія сполучної тканини.
• Ядришкове. Даний тип світіння характерний для системного червоного вовчака, поліміозиту, синдрому Шегрена та склеродермії.
• Центромірне. Можливі патології: кальциноз шкіри, езофагеальна дисфункція, синдром Рейно, телеангіектазія, склеродактилія.
• Цитоплазматичне. Подібне світіння говорить про аутоімунні захворювання печінки або про поліміозит.

АНФ знижений

Зменшення рівня антинуклеарних антитіл має клінічно важливе значення виключно при прогнозуванні та моніторингу наявних та раніше виявлених системних захворювань.

Показник АНФ залежить від інтенсивності патологічного процесу. У зв'язку з цим його зменшення – це сприятлива ознака, що свідчить про те, що лікування було проведено успішно, а хвороба перейшла до стадії ремісії.

Лікування

Кожна патологія аутоімунного характеру потребує певного терапевтичного підходу. Мета проведення дослідження крові на АНФ – виявити в рідкій сполучній тканині антитіла та оцінити характер їхньої взаємодії зі специфічними антигенами. На підставі результатів діагностики лікар може заздалегідь поставити діагноз. На його підтвердження необхідно проведення додаткових досліджень. І лише після цього лікарем складається схема лікування. Вибір медикаментозних засобівбезпосередньо залежить від цього, яка патологія виявлено в людини.

Вартість

Здати аналіз АНФ можна у незалежній лабораторії, приватній клініці чи державному медичному закладі. Важливо знати, що не у всіх бюджетних поліклініках подібна послуга надається. Щодо її наявності необхідно уточнювати у реєстратурі.

Дослідження є платним навіть у державних медичних закладах. Вартість аналізу безпосередньо залежить від цінової політики клініки, що складається з багатьох факторів. Мінімальна ціна становить 1000 рублів, максимальна вбирається у 1700 рублів. Крім того, необхідно додатково сплатити забір крові. Вартість цієї послуги, як правило, не перевищує 200 рублів.

На закінчення

Абревіатура АНФ розшифровується як антинуклеарний фактор. У нормі він не повинен бути присутнім у крові здорової людиниабо його концентрація повинна бути менше 1:160. Аналіз на АНФ призначається для того, щоб виявити у пацієнта патології аутоімунного характеру на ранній стадії їх розвитку.

Суть методу: при проникненні в організм агентів, що провокують, захисною системою починають вироблятися антитіла. Їхнє завдання - атакувати антигени та знищити їх. Для виявлення цієї реакції у пацієнта здійснюється забір венозної крові з наступним відділенням сироватки. В останню додають специфічні антигени та оцінюють подальші реакції.

Давно я хотіла написати про антинуклеарний фактор, але мене щось щось зупиняло. Чому? Ну тому що писати про це - це намагатися осягнути неосяжне, а стислість - явно не сестра мого таланту)))

Визначення антинуклеарного фактора (АНФ) – основний метод виявлення антинуклеарних антитіл, який дозволяє виявити більшість різновидів антинуклеарних антитіл. Результатом визначення АНФ є факт присутності аутоантитіл, кінцевий титр розведення сироватки і тип світіння ядра клітини.

АНФ-це не одне антитіло!

Метод виявлення АНФ був розроблений Таном (1982), який застосував як субстрат людську клітину, що перевивається епітеліоїдну лінію HEp-2 (ви могли бачити цю назву в бланку аналізу). Ця клітинна лінія одержана з пухлини гортані людини (аденокарциноми). Порівняльна невибагливість цієї лінії, великі ядра і присутність всіх людських антигенів зробило метод непрямої імунофлюоресценції (нРІФ) з використанням клітинної лінії, що перевивається, НЕр-2 основним методом виявлення АНФ.

Як субстрати можуть застосовуватися й інші клітинні лінії (см карусель), проте завдяки гарній морфології та зручності культивування саме лінія Нер-2 стала загальновизнаним субстратом непрямої імунофлюоресценції. В англомовній літературі іноді цей метод позначають як FANA (Fluorescent AntiNuclear Antibody detection).

Іноді під терміном «антинуклеарні антитіла» імунологічні лабораторії називають тести, як засновані на методах імуноферментного та імунохімічного аналізу, так і метод імунофлюоресценції.
Антинуклеарний фактор (АНФ) – це антитіла, виявлені імунофлюресцентним методом.
Необхідно виявляти АНФ класу IgG, оскільки виявлення АНФ, представлених іншими класами імуноглобулінів, не має самостійного значення.

Титр АНФ визначається як останнє розведення сироватки хворого, яке має чітку флюоресценцію (свічення) ядер клітин. При використанні клітинної лінії нер-2 рекомендується використовувати вихідний титр 1:80, у цьому випадку в нормі титри АНФ менше 1:160. Для визначення кінцевого титру зазвичай використовується титрування кроком х2 (1:160-1:320 - 1:640 - 1:1280 - 1:2560 - 1:5120 і т.д.).

На тлі загострення захворювання зазвичай відзначаються титри АНФ понад 1:640, а при ремісії титри можуть знижуватись до 1:160-1:320.

Бальна оцінка результатів виявлення («в хрестах» +++) дозволяє лабораторіям економити реактиви та зменшити трудовитрати на виконання досліджень. У цьому випадку визначення кінцевого титру не є можливим❌

Бажано визначати кінцевий титр у всіх позитивних хворих, що дозволяє уточнювати присутність у сироватці аутоантитіл, які більш тісно пов'язані з активністю процесу.

ТИПИ СВІЧЕННЯ ЯДРУ

Тип свічення ядра - одна з ключових характеристик при виявленні АНФ. Кожен різновид антинуклеарних антитіл (ANA) має конкретні мішені в клітині та відображає взаємодію сироватки хворого зі структурами всередині клітини. Тип світіння залежить від присутності конкретних аутоантитіл у крові, на основі чого можна зробити попередній висновок щодо тих різновидів антитіл, які є в даній сироватці. Тип свічення ядра клітини значно збільшує інформативність виявлення АНФ.

Використання клітин лінії НЕр-2 дозволяє охарактеризувати більше 20 різних варіантів фарбування ядра, проте для клінічної практики достатньо виділити основні. Кожному типу світіння властиві дуже характерні ознакиякі дозволяють відрізнити один варіант від іншого.

При гомогенному типі свіченняаутоантитіла реагують з антигенами, які розподілені в ядрі дифузно, тобто. входять до складу хроматину.

За рахунок чого? Антитіла проти нуклеосу, ДНК, гістонів.

Коли? У хворих із ВКВ та лікарським вовчаком, а також у хворих зі склеродермією.

Часто виявлення високого титру АНФ із гомогенним типом світіння свідчить про діагноз ВКВ.

Периферичний тип свіченняможуть виділяти окремо, хоча він є різновидом гомогенного. Периферичний тип світіння виявляється у хворих з антитілами до двоспіральної ДНК та виявляється переважно при ВКВ, захворюваннях печінки.

Гранулярний тип (крапчастий, сітчастий)є найчастішим і, одночасно, найбільш неспецифічним.

За рахунок чого? Sm, U1-RNP, SS-A, SS-B антигени та PCNA.

Коли? ВКВ, хвороба/синдром Шегрена, склеродермія, дерматоміозит/поліміозит, РА та інших хвороб. Низькі титри (1:160-1:320) АНФ з гранулярним типом світіння можуть бути в сироватках крові у клінічно здорових осіб. системного захворювання.

Виявлення дуже високих титрів АНФ (1:2560-1:10000) з великогранулярним типом свічення ядра зазвичай вказує на діагноз і потребує дообстеження для виявлення RNPантигена.

Антигени ядерця можуть виступати як мішені АНА, що призводить до виявлення Ядерного типу флюоресценції.

За рахунок чого? PHК полімераза 1, NOR, U3RNP, PM/Scl.

Коли? Склеродермія та її різновиди.

Центромірний типвідзначається при появі антитіл до центромірів хромосом, і виявляється тільки в клітинах, що діляться. Його присутність характерна при CREST-синдромі (варіант склеродермії).

Цитоплазматичний тип свічення.

За рахунок чого? Антитіла до тРНК-синтетазів, зокрема Jo-1, які спостерігаються при поліміозиті. Крім того, він виявляється у хворих на АНА, спрямовані проти інших компонентів цитоплазми клітини: при аутоімунному гепатиті, при первинному біліарному цирозі.

Можна охарактеризувати низку інших різновидів світіння. Антитіла до SCL-70 дають дрібногранулярнефарбування ядра і ядерців, анти-р80 - крапки, що світяться в ядрі, які відсутні в мітотичних клітинах.

Нерідко може зустрічатися поєднання кількох типів світіння, наприклад дрібногранулярного та ядерця, що характерно для антитіл до Scl-70.

Іноді в низьких розведеннях переважає один тип свічення, наприклад, гранулярний, а при подальших розведеннях виявляється гомогенний або центромірний типи флюоресценції, що свідчить про наявність у сироватці хворого різних видів АНА.

Системні ревматичні захворювання
Антинуклеарний фактор (АНФ) та тип свічення

Визначення антинуклеарного фактора (АНФ) є основним методом виявлення антинуклеарних антитіл, який дозволяє виявити більшість різновидів антинуклеарних антитіл, включаючи аутоантитіла до нуклеїнових кислот (дсДНК, осДНК, РНК), конформаційних і нерозчинних антигенів. Результатом визначення АНФ є факт присутності аутоантитіл у діагностичному титрі, кінцевий титр розведення сироватки, що відображає афінність та концентрацію аутоантитіл, а також тип свічення ядра клітини (тест 01.02.15.005). Характеристики конкретної методики залежать, перш за все, від вибору субстрату, який може варіювати від кріосрізів (щурових печінки або нирки) до культивованих проліферуючих клітинних ліній (Hep2, Kb, HeLa), а також методу фіксації тканини, який може впливати на збереження ряду ядерних антигенів АНА.

Історія розробки тестів для виявлення антинуклеарних антитіл:

Початок ХХ століття - "гіалінові тільця" в цитоплазмі лейкоцитів

1948 Hargraves, Richmond, Morton - метод виявлення LE-клітин invitro при тривалій інкубації лейковзвеси хворих на ВКВ

1951 Lee, Michael, Vural - виявили сироватковий фактор, що стимулює фагоцитоз ядер лімфоцитів лейкоцитами периферичної крові

1957 Holoborow, Weir, Johnson використовували метод непрямої імунофлюоресцнеції, розроблений Coons в 1950 для виявлення АНФ на кріосрізах печінки людини

1961 Beck - використовував тканини лабораторних тварин

1982 Tan — використовував клітинну лінію людини HEp-2, що перевивається, цей тест став золотим стандартом виявлення АНА

1958 Jones - виявив у крові хворих синдромом Шегрена фактор, здатний преципітувати екстракти ядер клітин, що послужило поштовхом для опису більшості різновидів антинуклеарних антитіл

Непряма імунофлюоресценція на клітинній лінії, що перевивається, Нер2

Методу виявлення АНФ був розроблений Таном (Tan, 1982), що застосував як субстрат людську клітину, що перевивається епітеліоїдна клітинна HEp-2 (ATCC ref.no. CCL-23). Це клітинна лінія, отримана з аденокарциноми гортані людини, являє собою великі поліплоїдні неороговіруючі плоскі епітеліоцити, що утворюють моношар на пластиці та склі.

Малюнок: клітини клітинної лінії НЕр-2, пофарбовані гематологічним барвником.

Порівняльна невибагливість цієї лінії, великі ядра і присутність всіх людських антигенів зробило метод непрямої імунофлюоресценції з використанням клітинної лінії, що перевивається, НЕр-2 основним методом виявлення АНФ. В англомовній літературі відсутня єдина назва цього методу, іноді цей метод для стислості позначають як FANA(Fluorescent AntiNuclear Antibody detection). Відсутність єдності номенклатури породила плутанину у назві лабораторних тестів. Іноді під терміном «антинуклеарні антитіла» імунологічні лабораторії називають тести, як засновані на методах імуноферментного та імунохімічного аналізу, так і метод імунофлюоресценції. У російськомовній літературі ми вважаємо за необхідне зберегти вітчизняну назву цього показника – «антинуклеарний фактор» (АНФ), щоб відрізнити імунофлюресцентний метод від інших тестів для виявлення АНА.

Необхідно виявляти АНФ класу IgG, оскільки виявлення АНФ, представлених іншими класами імуноглобулінів немає самостійного діагностичного значення. Стандартні розведення сироватки хворого інкубуються з тканинним субстратом, що дозволяє антинуклеарним антитілам із сироватки хворого зв'язатися з відповідними ядерними мішенями. Після цього місця зв'язування аутоантитіл детектуються за допомогою антилюдської антисироватки, міченої флюоресцеїном.

Хоча як субстрати можуть застосовуватися й інші людські клітинні лінії, проте завдяки гарній морфології та зручності культивування саме ліній Нер-2 стала загальновизнаним субстратом непрямої імунофлюоресценції. Її застосування покращує чутливість тесту за рахунок яскравої флюоресценції навіть при значних розведеннях сироватки хворого, а велике багате еухроматином ядро ​​дозволяє точно описати тип світіння. Крім того, застосування клітинної лінії Hep-2 сприяє виявленню антитіл Ro/SS-A, а також антитіл до антигенів ядерця, які погано при використанні кріосрізів тканини лабораторних тварин. Серед інших переваг HEp-2 можна відзначити високу частоту поділу клітин, що дозволяє виявляти антитіла до антигенів, що експресуються тільки при розподілі клітини, і відсутність клітинного матриксу тканини, що ускладнює візуалізацію специфічного світіння порівняно з гістологічними зрізами.

Титри антинуклеарного фактора

Титр АНФ визначається як останнє розведення сироватки хворого, яке має чітку флюоресценцію ядер клітин. При використанні тканин лабораторних тварин діагностичний титр АНФ становить 1:8-1:10, тоді як при використанні клітинної лінії НЕр-2 рекомендується використовувати вихідний титр 1:80. І тут у нормі титри АНФ менше 1:160.

При використанні титрів менше 1:160 частота слабопозитивних результатів у клінічно-здорових осіб становитиме не більше 5%, і в той же час не дозволить пропустити значні титри АНА у хворих на дифузні хвороби сполучної тканини.

Для визначення кінцевого титру зазвичай використовується титрування кроком х2 (1:160-1:320 - 1:640 - 1:1280 - 1:2560 - 1:5120 і т.д. Може використовуватися і більш грубе титрування. На тлі загострення ревматичних захворювань зазвичай відзначаються титри АНФ більше 1:640, а ремісії титри знижуються до 1:160-1:320.

Існують рекомендації щодо бальної оцінки результатів виявлення АНФ, що вказує зміст «в хрестах». Це дозволяє лабораторіям економити реактиви та зменшити трудовитрати на виконання досліджень. У цьому випадку визначення кінцевого титру неможливо. Необхідно враховувати, що кінцевий титр має більш важливе значення, порівняно з кількістю аутоантитіл, що зв'язалися з субстратом, оскільки безпосередньо пов'язаний з афінністю їх взаємодії з антигеном. Бажано визначати кінцевий титр у всіх позитивних хворих, що дозволяє уточнювати присутність у сироватці високоафінних аутоантитіл, які більш тісно пов'язані з активністю процесу.

Тип свічення ядра антинуклеарного фактора

Вже в першому досвіді клінічного застосування непрямої імунофлюоресценції для виявлення АНФ з використанням кріосрізів тканин лабораторних було відзначено, що сироватка хворих на аутоімунні захворювання захворюваннями по-різному «фарбувала» ядра клітин, що призводило до селективного світіння деяких структур ядра. Уточнення цього феномена призвів до опису про «типів світіння» ядра в імунофлюоресцентному тесті. Це пов'язано з тим, що кожен різновид АНА має конкретні клітинні мішені, внаслідок чого тип світіння ядра, ядерця і цитоплазми клітини відображає взаємодію АНА сироватки хворого з антиген-структурами всередині клітини. Тип світіння залежить від присутності конкретних аутоантитіл у сироватці крові хворого, на основі чого можна зробити попередній висновок щодо тих різновидів АНА, які є в даній сироватці. Однак застосування гістологічних зрізів тканин лабораторних тварин не дозволяє встановити тип свічення. У той же час використання клітинних ліній, що перевиваються, таких як Нер-2 дозволяє описати значну кількість варіантів фарбування ядра і цитоплазми. Існує три основні групи антигенів, присутність антитіл до яких визначає різні типисвітіння:

Тип світіння ядра клітини значно збільшує інформативність виявлення АНФ, у зв'язку з чим повинен рутинно визначатися при визначенні цього показника. Використання клітин лінії НЕр-2 дозволяє охарактеризувати більше 20 різних варіантів фарбування ядра, які залежать від спектру АНА, присутніх у сироватці, що досліджується. Однак для практичної лабораторії достатньо розрізняти 6 основних варіантів звикли аутоантитіл з антиген-містять структурами клітини.

Виділяють гомогенний, периферичний, гранулярний (дрібно-/велико-), ядерцевий, центромірний та цитоплазматичний типи свічення ядра. p align="justify"> Кожному типу світіння властиві дуже характерні ознаки, які дозволяють відрізнити один варіант від іншого, а також набір антигенів, з якими реагують аутоантитіла в сироватках хворих. Опис типів світіння представляє цінну клінічну інформацію саме собою, крім того, тип світіння може вказувати на необхідність проведення певних лабораторних тестів надалі.

При гомогенному типісвітіння аутоантитіла реагують з антигенами, які розподілені в ядрі дифузно, тобто. входять до складу хроматину. Характерно, при виявленні гомогенного типу світіння, клітинах, що діляться, яскраво забарвлюються конденсовані хромосоми. Основними структурними одиницями хроматину є нуклеосоми – комплекси ДНК та гістонів. Таким чином, гомогенний тип свічення передбачає наявність антитіл проти нуклеросом, дсДНК та антитіл до гістонів. Він зустрічається у хворих із ВКВ та лікарським вовчаком, а також у хворих зі склеродермією. Зазвичай виявлення високого титру АНФ із гомогенним типом світіння свідчить про діагноз ВКВ.

Периферичний тип свічення часто виділяють окремо, хоча він є різновидом гомогенного типу свічення. Його виявлення є артефактом фіксації клітин, що призводить до перерозподілу хроматину в ядрі на периферію. Важливо відрізняти периферичний тип свічення від фарбування ядерної мембрани, що відзначається при аутоімунних захворюваннях печінки. Периферичний тип світіння виявляється у хворих з антитілами до двоспіральної ДНК і виявляється переважно у хворих із ВКВ.

Гранулярний тип є найчастішим і, одночасно, найбільш неспецифічним. Іноді цей тип світіння у вітчизняній літературі називають «крапчастим» чи «сітчастим». Назва «гранулярний» більш точно відображає цей феномен, тому що в цьому випадку аутоантитіла реагують з гранулами в ядрі, що представляють нуклеопротеїнові комплекси надмолекулярні. Такі комплекси білків та нуклеїнових кислотздійснюють у ядрі ряд функцій, необхідні нормального функціонування клітини. До таких комплексів, зокрема, належать сплайсосоми, які здійснюють посттранскрипційну перебудову мРНК, необхідну синтезу білка на рибосомах. У складі є безліч різних нуклеопротеїнів, що зумовлює різноманітність антигенних мішеней при виявленні гранулярного типу світіння. До основних аутоантигенів, антитіла яких призводять до візуалізації гранулярного типу світіння, відносять Sm, U1-RNP, SS-A, SS-B антигени і PCNA. Клітини в процес розподілу втрачають більшість сформованих нуклеопротеїнових комплексів, тому мітотичні фігури клітинної лінії при гранулярному типі світіння не фарбуються. Гранулярний тип світіння ядра відзначається у хворих при ВКВ, СШ, СС, ДМ/ПМ, РА та інших аутоімунних захворюваннях. Низькі титри АНФ з гранулярним типом переважають у сироватках крові у клінічно здорових осіб з АНФ без ознак системного захворювання.

Виявлення дуже високих титрів АНФ (1:2560-1:10000) з великогранулярним типом свічення ядра зазвичай вказує на діагноз змішаного захворювання сполучної тканини і вимагає дообстеження для виявлення RNPантигена, який є основним серологічним маркером цього захворювання.

Антигени ядерця можуть виступати як мішені АНА, що призводить до виявлення ядерцевого типуфлюоресценції. Виявлення ядерного типу свічення характерне для склеродермії та її різновидів. Ядерцевий тип флюоресценції визначається у хворих за наявності антитіл до компонентів ядерця, таким як PHК полімераза 1, NOR, U 3 RNP, PM/Scl.

Центромірний тип Флюоресценція відзначається при появі антитіл до центромірів хромосом, і виявляється тільки в клітинах, що діляться. Його присутність характерна при варіанті CREST склеродермії.

Цитоплазматичний тип свічення вказує на антитіла до тРНК-синтетазів, зокрема Jo-1, які відзначаються при поліміозит. Крім того, він виявляється у хворих з АНА, спрямованими проти інших компонентів цитоплазми клітини: антитіла до актину при аутоімунному гепатиті, антитіла до мітохондрії при первинному біліарному цирозі.

Можна охарактеризувати ряд інших різновидів світіння, причому ці типи фарбування ядра клітин можуть бути характерними для конкретного різновиду АНА. Так антитіла до Scl-70 в імунофлюоресцентному тесті на HEp-20 клітинах дають дрібногранулярне фарбування ядра і ядерців, анти-р80 - крапки, що світяться в ядрі, які відсутні в мітотичних клітинах. Однак необхідно вказати на рідкість та різноманітність таких феноменів, що робить зайвим їхнє виявлення при рутинних дослідженнях.

Нерідко може зустрічатися поєднання кількох типів світіння, наприклад дрібногранулярного та ядерця, що характерно для антитіл до Scl-70. Більш того, часто в низьких розведеннях переважає один тип свічення, наприклад гранулярний, а при подальших розведеннях виявляється гомогенний або центромірний типи флюоресценції, що свідчить про наявність у сироватці хворих різних видів АНА. Хоча тип світіння дає лікарю певні дані на користь того чи іншого діагнозу, необхідно брати до уваги порівняно низьку його специфічність і різноманітність феноменів, що зустрічаються, що вимагає подальшого лабораторного обстеження.

Виявлення АНФ є основою використання інших лабораторних тестів, уточнюючих спектр АНА у крові хворих. З огляду на крайню інформативність цього тесту, подальше тестування та аналіз результатів подальшого обстеження має інтерпретуватися залежно від результатів оцінки типу свічення та титру АНФ.

Хоча відсутність значних титрів АНФ практично завжди виключає діагноз активного системного ревматичного захворювання, але при використанні клітинної лінії НЕр-2, у 2-4% хворих, що задовольняють критеріям для діагнозу ВКВ, АНА не визначаються або низькі титри. Цих хворих іноді відносять до групи « АНФ-негативною ВКВ», для уточнення діагнозу у таких хворих потрібно подальше обстеження, насамперед виявлення антитіл до SS-A-антигенів. Ці антигени мають гарну розчинність і можуть втрачатися з ядер клітин. Для скорочення цієї категорії пацієнтів використовується комплексне тестування, що включає визначення антитіл до ядерних антигенів, що екстрагуються, так званий « скринінг захворювань сполучної тканини», тест 000723. Негативний результат такого обстеження дозволяє з дуже високою ймовірністю дозволяє виключити діагноз ВКВ та інших системних ревматичних захворювань.

Інтерпретація результатів досліджень містить інформацію для лікаря і не є діагнозом. Інформацію з цього розділу не можна використовувати для самодіагностики та самолікування. Точний діагноз ставить лікар, використовуючи як результати даного обстеження, і необхідну інформацію з інших джерел: анамнезу, результатів інших обстежень тощо.

Одиниці виміру: титр.

Інтерпретація результатів

Результатом визначення АНФ є титр, що є значенням кінцевого розведення сироватки, при якому зберігається значуща флюоресценція ядра. Чим вище знаменник дробу, тим більше розведення сироватки, тим більше антитіл у сироватці хворого. Високі титри розведення сироватки відображають високу афінність та концентрацію аутоантитіл.

Виявлення високих тирів (1/640 і вище) вказує на високу ймовірність системного ревматичного захворювання або аутоімунного захворювання печінки та потребує уважного клінічного, лабораторного та інструментального обстеження. Відсутність підвищених титрів антинуклеарного фактора значно знижує ймовірність системних аутоімунних захворювань.

У низьких титрах (до 1/160) антинуклеарний фактор може відзначатися у 1-2% здорових осіб та родичів хворих із системними захворюваннями. Частота позитивних титрів у популяції дещо збільшується із віком. Низькі титри антинуклеарних антитіл можуть зустрічатися при багатьох аутоімунних, інфекційних та онкологічних захворюваннях. Відсутність високих титрів антинуклеарних антитіл значно знижує ймовірність системного ревматичного процесу і може використовуватися швидше для виключення, ніж підтвердження діагнозу.

Підвищення титрів АНФ у динаміці вказує на загострення системного захворювання, так при ВКВ титр корелює з тяжкістю процесу та знижується при ефективній терапії.

Крім титру сироватки, при позитивному результаті аналізу описується тип свічення ядра. Він обумовлений широким спектром антитіл, які знаходять свої цілі всередині клітини. Описано понад 20 типів світіння, однак у клінічній практиці використовується 8 із них:

Референсні значення:< 1:160

Іноді можуть бути описані 2 типи свічення, при якому один у низьких титрах маскує інший. При виявленні позитивного результатуАНФ необхідно постаратися встановити антигенні мішені антинуклеарних антитіл, за допомогою тестів виявлення антитіл до двоспіральної ДНК (№126) та антитіл до нуклеосом (№956), імуноблоту антинуклеарних антитіл (№827), імуноблоту антитіл при склеродермії (№826) поліміозит (№ 939) і визначення антитіл до кардіоліпіну (№ 967-969, 997).